Nata a San Giorgio di Piano, Bologna, nel 1920.
Trasferitasi a Roma giovanissima, dopo aver frequentato l'Università, si lanciò nel mondo dello spettacolo battendo molte strade: come cantante, ballerina, attrice di teatro, violinista. Ma si affermò grazie alla radio, protagonista nel 1942 della trasmissione Cico e Pallina, curata, fra gli altri, da Federico Fellini.
L'anno successivo la Masina e Fellini si sposarono.
Il primo ruolo importante nel cinema, l'attrice lo ottenne nel 1948 in Senza pietà, del regista Alberto Lattuada, ma a darle la notorietà internazionale fu il sodalizio, anche artistico, con Fellini.
La Masina fu presente fin dal primo film del marito, Luci del varietà (1951), codiretto con Lattuada, e poi anche ne Lo sceicco bianco (1952), e ne La strada (1954) dove, finalmente protagonista, si impose nel ruolo della candida e ingenua Gelsomina.
Gli altri grandi incontri con Fellini furono: Le notti di Cabiria (1957), nel ruolo della prostituta protagonista, altra anima candida ma volitiva, Giulietta degli spiriti (1965) e Ginger e Fred (1985), film con cui, dopo un periodo di appannamento, tornò a conquistare l'interesse della critica e le simpatie del pubblico.
Lontano da Fellini vanno citati Fortunella (1958) di Eduardo De Filippo, in versione brillante accanto a Sordi, e Nella città d'inferno (1958) di Castellani, in versione drammatica accanto alla Magnani.
Da ricordare anche alcune esperienze televisive, come Eleonora (1972), di grande successo.
Favorita anche dal fisico minuto e dall'espressione naturalmente timida, la Masina ha impersonato magistralmente un tipo di donna remissiva e un po' triste: davvero l'immagine femminile di un'epoca.